Efecto del inhibidor de fosfodiesterasa tipo 4 —rolipram, sobre la maduración in vitro de oocitos bovinos

Yuddy S. López, Ana M. Mejía, Elder E. Escobar, Bernardo Agudelo Jaramillo, Neil A. Vásquez, Hernán Echavarría

Abstract


Resumen

Durante el proceso de maduración in vitro de oocitos, las gonadotropinas FSH y LH inducen la producción de AMPc. El AMPc tiene efecto dual, donde los altos niveles de AMPc intraoocitario mantienen su bloqueo meiótico, mientras que en las células de la granulosa inducen la maduración del oocito. Los niveles de AMPc son regulados por hidrólisis mediada por fosfodiesterasas (PDE), las cuales presentan expresión específica en el folículo, el oocito expresa la PDE 3, mientras que las células de la granulosa PDE 4. Con el objetivo de evaluar el efecto del rolipram, un inhibidor específico de PDE 4, sobre el porcentaje de maduración nuclear in vitro (MNIV) de oocitos bovinos, 629 complejos cúmulo oocito (CCO) fueron cultivados a 38.5 ºC/5% CO2/24 h, en medio TCM-199 con la adición de pFSH y hrLH, o rolipram. Los grupos experimentales fueron: adición de gonadotropinas, rolipram (25, 50 ó 75 µM), rolipram 50 µM + gonadotropinas, o control sin estímulo. Los oocitos fueron teñidos con DAPI y evaluados bajo fluorescencia para determinar el porcentaje de maduración nuclear por la expulsión del primer cuerpo polar. El rolipram 50µM estimuló la maduración nuclear de oocitos bovinos de una manera similar a la obtenida con las gonadotropinas (76.83 vs 79.46%, p > 0.05), pero en mayor medida que la observada con rolipram 25 y 75 µM (31.25, y 28.61%, respectivamente). Los CCOs cultivados en presencia de rolipram 50 µM+Gonadotropinas maduraron en menor proporción (63.74%) comparada con gonadotropinas (p < 0.01) o rolipram 50 µM (p < 0.05). Los resultados permiten concluir que el porcentaje de maduración nuclear in vitro de oocitos bovinos depende de la dosis de rolipram utilizada, donde la concentración de rolipram 50 µM presentó un comportamiento similar a las gonadotropinas en la maduración del oocito. Además, la presencia del estímulo gonadotrópico y del inhibidor de PDE puede inducir una respuesta de desensibilización de la vía del AMPc, reflejada en una disminución del porcentaje de maduración.

Palabras clave: AMPc intracelular, complejos cúmulo-oocito, enzima fosfodiesterasa, meiosis bovina, metafase II.

 

Summary

Gonadotropic follicle stimulating hormone (FSH) and lutenizing hormone (LH) induce intracellular cyclic AMP (cAMP) production during the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes. Cyclic AMP exerts a dual effect, where high intraoocyte cAMP levels are responsible for oocyte meiotic blockage, while high cAMP levels into the granulose cells induce oocyte maturation. Intracellular cAMP levels are regulated by phosphodiesterases (PDE)-mediated hydrolysis, enzymes having a specific follicle expression pattern. Oocyte expresses typo 3 PDE (PDE 3), while granulose cells expresses type 4 PDE (PDE 4). With the aim to test the effect of the specific PDE 4 inhibitor rolliprom on percentage in vitro nuclear maturation (IVNM) of bovine oocytes, 629 cumulus-oocyte complexes (COC) were cultured at 38.5 ºC/CO2 5%/24 h on TCM-199 medium with pFSH and hrLH with or without rolipram. Experimental groups were: gonadotrophins alone, gonadotropins + rolipram (25, 50, or 75 µM), rolipram 50 µM + gonadotrophins, and control (media without stimulus). In order to determinate the nuclear maturation percentage by the first polar body expulsion, oocytes were dyed with DAPI and evaluated by fluorescence. Rolipram 50 µM stimulated bovine oocyte nuclear maturation in a similar way to gonadotrophins stimulus (76.83 vs. 79.46%, p > 0.05) did, but in a higher way than rolipram 25 µM (31.25%) or 75 M (28.61%). The COC cultured with rolipram 50 µM+gonadotrophins maturated in a lower proportion (63.74%) than did with gonadotropins (p < 0.01) or rolipram 50 µM (p < 0.05). A dose-dependent response of percentage of IVNM of bovine oocytes was detected. Thus rolipram 50 µM, exerts a similar effect of gonadotropins on oocyte maturation. In addition, the presence of gonadotropic stimulus and a PDE inhibitor may induce a desensitization response of the cAMP way, as suggested by the reduction of the percentage of maturation.

Key words: bovine meiosis, cumulus-oocyte complex, intracellular cAMP, metaphase II, phosphodiesterase enzyme.

 

Resumo

Durante o processo de maturação in vitro de oocitos, as gonadotrofinas FSH e LH induzem a produção de AMPc. O AMPc tem duplo efeito, pois os altos níveis de AMPc intraoocitario mantém o bloqueio meiótico, enquanto que nas células da granulosa induzem a maturação do oocito. Os níveis de AMPc são regulados pela hidrólise mediada das fosfodiesterasas (PDE), as quais apresentam expressão específica no folículo, o oocito expressa a PDE 3, enquanto que as células da granulosa PDE 4. Com o objetivo de avaliar o efeito do rolipram, um inibidor específico de PDE 4, sobre a percentagem de maturação nuclear in vitro (MNIV) de oocitos bovinos, 629 complexos cúmulo oocito (CCO) foram cultivados a 38.5 ºC/5% CO2/24 h, em meio TCM-199 com a adição de pFSH e hrLH, o rolipram. Os grupos experimentais foram: adição de gonadotrofinas, rolipram (25, 50 ó 75 µM), rolipram 50 µM + gonadotrofinas, ou controle sem estímulo. Os oocitos foram tingidos com DAPI e avaliados sob fluorescência para determinar a percentagem de maturação nuclear pela expulsão do primeiro corpo polar. O rolipram 50 µM estimulou a maturação nuclear de oocitos bovinos de maneira similar a obtida com as gonadotrofinas (76.83 vs 79.46%, p > 0.05), porém em maior medida que a observada com rolipram 25 y 75 µM (31.25, y 28.61%, respectivamente). Os CCOs cultivados na presença de rolipram 50 µM+Gonadotrofinas maturaram em menor proporção (63.74%) quando comparado com gonadotrofinas (p < 0.01) ou rolipram 50 µM (p < 0.05). Os resultados permitem concluir que a percentagem de maturação nuclear in vitro de oocitos bovinos depende da doses de rolipram utilizada, sendo que a concentração de rolipram 50 µM apresentou um comportamento similar às gonadotrofinas na maturação do oocito. Ale disto, a presença do estímulo gonadotrópico e do inibidor de PDE podem induzir uma resposta de diminuição na sensibilização da via do AMPc, refletida numa diminuição da percentagem de maturação.

Palavras chave: AMPc intracelular, complexos cúmulo-oocito, enzima fosfodiesterasa, meiosis bovina, metafase II.


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