Identification of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis by PCR techniques and establishment of control programs for bovine paratuberculosis in a dairy herds.

Margarita Maria Zapata Restrepo, Ofelia Arroyave Henao, René Ramirez García, Christian Piedrahita Ochoa, Juan David Rodas González, Juan Guillermo Maldonado Estrada

Abstract


The aim of this study was to establish the protocol of conventional and real time PCR for amplification of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) genome from bovine fecal samples, as a way to define strategies for establishing a prevention and control program in a dairy herd at the Universidad de Antioquia (Medellín, Colombia). Fecal samples were individually taken of clinical healthy cows or cows with diarrhea bred in a herd enzootic for Johne’s disease, were processed them for culture in liquid Middlebrook 7H9 media supplemented with mycobactin under two different protocols: with or without inhibitors. Fecal samples from clinically healthy cows were used as negative control. Conventional and real time PCR were performed with MAP DNA obtained of fecal or cultured samples. The MAP- specific IS900 segment was amplified by using the respective forward and reverse primers. DNA isolated from a reference MAP strain was used as positive control of PCR. Data were analyzed by descriptive statistics and simple regression analysis between PCR and culture results were performed. All samples cultured in media with or without mycobactin gave a positive result compatible with MAP growth. However, only 13,3% of samples were positive by real time PCR. There was no relationship neither between PCR and 18 Zapata-Restrepo M et al. Identification and control of bovine paratuberculosisculture results, nor between clinical condition of the cow and MAP positivity. These results support the need combine culture of feces with PCR diagnosis for identification of MAP-excreting cows in a dairy herd. Finally, a strategy of prevention and control of bovine paratuberculosis is proposed for this enzootic herd and for dairy herds in Colombia.

Key words: bacterial culture, bovine paratuberculosis, caquexia in cows, dairy cows, Johne’s disease, real–time PCR.

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Identificación de Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis mediante pruebas de PCR y definición de programa de control de la paratuberculosis bovina en hatos lecheros

Resumen
El objetivo de este trabajo fue establecer un sistema de detección y amplificación del Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) a partir de muestras de materia fecal bovina, mediante el uso de la técnica de PCR en tiempo real, como estrategia de apoyo para el establecimiento de un programa de prevención detección y control de la paratuberculosis bovina en el hato lechero de la Universidad de Antioquia. Muestras de materia fecal fueron tomadas de bovinos provenientes de un hato enzoótico para la enfermedad de Johne, fueron cultivadas en medio de cultivo líquido Middlebrook 7H9 suplementado con micobactina, bajo dos protocolos de aislamiento: con o sin inhibidores. Como control negativo fue utilizada muestras de materia fecal de bovinos clínicamente sanos. Adicionalmente, con el DNA de las muestras aisladas en cultivo y de las muestras de materia fecal, fueron hechas pruebas de PCR convencional y en tiempo real, para la amplificación del elemento de inserción IS900 del MAP, mediante el uso de cebadores específicos para este elemento. Como control positivo se utilizó DNA de MAP de una cepa de referencia. Los resultados fueron evaluados mediante estadística descriptiva y la comparación entre el resultado del cultivo y de la prueba de PCR fue evaluado mediante regresión simple. Los resultados del cultivo bacteriológico, mostraron un total de 15 muestras con crecimiento compatible con MAP, el cual fue verificado por prueba de PCR en el 13.3% de los casos. No hubo correlación entre el resultado de cultivo y la prueba de PCR ni entre el estado clínico y la positividad al MAP. Los resultados confirman la necesidad de combinar el diagnóstico molecular con el cultivo bacteriológico para identificar las vacas positivas en un hato. Finalmente, una trategia de prevención y control de la enfermedad aplicable a este hato enzoótico y a los hatos lecheros en Colombia es discutida.

Palabras clave: bovinos de leche, caquexia en vacas, cultivo bacteriológico, enfermedad de Johne, paratuberculosis bovina, PCR en tiempo real.

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Identificação de Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis por PCR e definição do programa de controle da paratuberculose em rebanhos bovinos leiteiros

Resumo
O objetivo deste estudo foi estabelecer um sistema de detecção e amplificação do Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) a partir de amostras fecais bovinas, utilizando a técnica de PCR em tempo real, como uma estratégia para apoiar o estabelecimento de um programa rastreio para a prevenção e controle de la paratuberculosis bovina no rebanho leiteiro da Universidade de Antioquia. Foram colhidas amostras de fezes de gado bovino a partir de uma fazenda enzoótica para a doença de Johne, e foram cultivadas em meio de cultura líquida Middlebrook 7H9 suplementado com micobactina, sob dois protocolos de isolamento: com ou sem inibidores. Foram utilizadas como controle negativo amostras fecais de bovinos saudáveis. Além disso, as amostras de DNA isoladas e cultivadas a partir de amostras fecais foram realizadas testes de PCR convencional e em tempo real, para amplificação elemento de inserção IS900 no MAP. Foi utilizado como controle positivo do teste DNA de uma estirpe de referencia. Os resultados foram avaliados por estatística descritiva e as comparações entre os resultados de cultura e teste PCR foram avaliadas por regressão simple. Os resultados de cultura bacteriológica mostraram 100% de crescimento em amostras com MAP, que foi verificada por PCR em 13,3% dos casos. Não houve correlação entre o resultado do cultivo e teste PCR ou entre a clínica e a positividade para MAP. Os resultados confirmam a necessidade de combinar o diagnóstico molecular com cultura bacteriológica para identificação positiva de vacas em um rebanho. Finalmente, uma estratégia de prevenção e controle da doença aplicável neste rebanho enzoótico e os rebanhos leiteiros e na Colômbia é discutida.

Palavras chave: a doença de Johne, caquexia em vacas, cultura bacteriológica, gado leiteiro, paratuberculose bovina, real-time PCR.


Keywords


bacterial culture, bovine paratuberculosis, caquexia in cows, dairy cows, Johne’s disease, real–time PCR

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